熒光是由喬治·加布里埃爾·斯托克斯在1852年首次被發(fā)現(xiàn)。他指出，螢石開(kāi)始發(fā)光后，用紫外光照射。熒光是一種形式的，它描述了由輻射產(chǎn)生的光子的材料被光照射后的光致發(fā)光。所發(fā)射的光具有比激發(fā)光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的。這種效應(yīng)被稱(chēng)為斯托克斯位移（Stokes shift）。

發(fā)光描述一個(gè)電子從激發(fā)態(tài)到較低的能量的狀態(tài)下的變化所造成的發(fā)光效應(yīng)的發(fā)生。電子可以存在于不同的能量狀態(tài)。電子的基態(tài)是一個(gè)非常穩(wěn)定的狀態(tài)，并具有最低的能量水平。如果電子吸收能量時(shí)，它們可以被提升到一個(gè)更高的能量水平，提供一個(gè)激發(fā)態(tài)。由于更高的能量比基態(tài)激發(fā)態(tài)，能量被釋放時(shí)返回它的基態(tài)電子。這種能量可以釋放的形式發(fā)射光子。

有幾種形式不同的方式，系統(tǒng)被激發(fā)，例如，在電致發(fā)光系統(tǒng)通過(guò)電流激發(fā)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光的發(fā)生是由于發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而從通過(guò)光子激發(fā)的光致發(fā)光的結(jié)果。

可以進(jìn)一步分成兩個(gè)小組，熒光和磷光的光致發(fā)光。熒光和磷光之間的主要區(qū)別是其發(fā)光的持續(xù)時(shí)間。熒光照明停止時(shí)立即結(jié)束。與此相反，磷光可以持續(xù)幾個(gè)小時(shí)后的激發(fā)已經(jīng)結(jié)束。

圖 1：當(dāng)使用一定波長(zhǎng)的光（激發(fā)波長(zhǎng)）的光子被吸收的分子的電子擊中的分子（例如熒光團(tuán)）。然后，電子被從它們的基態(tài)（S ₀）提升到一個(gè)更高的能量水平，激發(fā)態(tài)（S ₁ '）。這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為激勵(lì)（1）。激發(fā)態(tài)壽命很短（通常為10 ^-9 -10 ^-8秒），在這段時(shí)間（2）的電子的能量損失。當(dāng)電子離開(kāi)（₁）激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)（3），他們失去了在激勵(lì)過(guò)程中采取了剩余的能量。在熒光基團(tuán)的情況下，能量被發(fā)射的光（熒光發(fā)射）的較長(zhǎng)波長(zhǎng)比激發(fā)光（并因此使用更少的能源）。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為斯托克斯移位。

熒光染料的熒光是當(dāng)它們存在對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)的光照射。的波長(zhǎng)取決于熒光團(tuán)的吸收光譜，它必須確保合適數(shù)量的能量被傳遞到提升到激發(fā)態(tài)的電子。后電子被激發(fā)，它們可以駐留在這種高能量的狀態(tài)下，只有很短的時(shí)間。當(dāng)電子放寬到基態(tài)或其他國(guó)家具有較低的能量水平，釋放能量，作為一個(gè)光子。在此過(guò)程中由于一些能量丟失，增加的波長(zhǎng)和能量較低的光由熒光染料相比，所吸收的光的發(fā)射。

圖 2：COS 7細(xì)胞，綠色：未知的蛋白，綠色熒光蛋白，紅色：α-微管蛋白，CY3，藍(lán)：細(xì)胞核，DAPI。禮貌的卞偉教授，細(xì)胞研究中心研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，上海生命科學(xué)研究院，中科院，上海，中國(guó)

 

圖 3：小鼠成纖維細(xì)胞，綠色：F-肌動(dòng)蛋白，F(xiàn)ITC紅：微管蛋白，CY5，藍(lán)核，DAPI。由君特·吉斯博士，醫(yī)學(xué)研究的馬克斯普朗克研究所，海德堡，德國(guó)

 

圖 4：小鼠海馬神經(jīng)元，藍(lán)標(biāo)記的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，綠色：肌動(dòng)蛋白，TRITC，紅色：紅色，灰色，德州GluA AMPA受體單元：突觸囊泡蛋白，CY 5

 

圖 5：果蠅幼蟲(chóng)，綠色：RNA結(jié)合蛋白，Alexa的488

 

磷光的機(jī)理

由于磷光的分子可以更長(zhǎng)的時(shí)間比熒光染料的發(fā)光，就必須有一個(gè)不同的方式中，它們存儲(chǔ)激發(fā)能量。這種差異的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)在兩種形式的激勵(lì)水平，單線激發(fā)態(tài)和激發(fā)三重態(tài)，這是基于對(duì)不同自旋對(duì)齊。

自旋電子的屬性。以簡(jiǎn)化的術(shù)語(yǔ)的自旋描述的電子通過(guò)其旋轉(zhuǎn)造成的角動(dòng)量。一個(gè)電子的自旋的方向可以是正的（1/2）或負(fù)（-1 / 2）。自旋對(duì)較高的能量水平可以是在它們的方向彼此平行或反平行。在反平行自旋對(duì)個(gè)別的角動(dòng)量相互補(bǔ)償，總自旋得到的值為零。這被稱(chēng)為自旋排列單線態(tài)。兩個(gè)平行的旋轉(zhuǎn)不補(bǔ)償，并得到一個(gè)非零的值。在這種情況下，自旋被說(shuō)成是在三重狀態(tài)。

熒光發(fā)生當(dāng)電子從單線激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。但在某些分子，被激發(fā)的電子的自旋可以切換到在這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為系統(tǒng)間橫穿三重態(tài)。這些電子失去能量，直到他們?cè)谌貞B(tài)。此狀態(tài)是更高的能量比基態(tài)，但也比單線激發(fā)態(tài)能量較低。因此，電子無(wú)法切換回單狀態(tài)，也不是他們可以輕松地返回到基態(tài)，總自旋允許值為零，由于量子力學(xué)。因此，這些分子都被困在他們的能量狀態(tài)。 

但是，來(lái)自三重態(tài)到基態(tài)的一些變化是可能的時(shí)間。這些變化會(huì)引起輻射產(chǎn)生的光子和磷光。由于只有少數(shù)事件是可能的時(shí)間，三重態(tài)呈現(xiàn)一種能源水庫(kù)，使磷光可能在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間段。

圖 6：果蠅幼蟲(chóng)體育場(chǎng)，綠色：Feb211陽(yáng)性神經(jīng)元和軸突，Alexa的488，紅色的纖維部分：中樞神經(jīng)系統(tǒng)（即所有軸突），CY3，藍(lán)核，DAPI。禮貌，德國(guó)克里斯托夫Melcher先生，博士研究所卡爾斯魯厄，毒物學(xué)和遺傳學(xué)研究所，Eggenstein-Leopoldshafen

 

圖 7：鼠標(biāo)腎部分，綠色：腎小球和曲小管，Alexa的488 WGA：F-肌動(dòng)蛋白（多見(jiàn)于腎小球和刷狀緣），紅，藍(lán)：細(xì)胞核，DAPI

 

 

 8：新生兒心肌細(xì)胞，黃色：DNA，的DAPI，綠：Myomesin，Cy3的紅色：鈣粘蛋白，德州紅，藍(lán)：肌動(dòng)蛋白，Alexa的633

 

圖 9：中期蔓延FISH - 收購(gòu)染色染色體熒光體視顯微鏡。的蘇托由美子博士，人類(lèi)演化實(shí)驗(yàn)室，前沿科學(xué)研究生院，東京大學(xué)提供

 

熒光顯微鏡

顯微鏡，熒光發(fā)光是最有用的一種。可以很容易地與他們的特定波長(zhǎng)通過(guò)特定的光源（例如燈和過(guò)濾系統(tǒng)或激光）可區(qū)別于所發(fā)射的光的激發(fā)光的波長(zhǎng)（斯托克斯移位）激發(fā)熒光染料。

使用熒光成像，實(shí)驗(yàn)者可以表征分子在細(xì)胞內(nèi)的量和本地化。熒光顯微鏡的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，可以同時(shí)使用多個(gè)熒光染料。的熒光染料只需要在他們的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)變化。因此，可以同時(shí)觀察到不同的目標(biāo)分子，允許一個(gè)巨大的各種試驗(yàn)，例如，以進(jìn)行共定位研究。